Le récit reprend exactement là où le premier Assassin's Creed s'est arrêté : Desmond est face à des inscriptions étranges écrites en sang sur le mur de sa chambre qu'il voit grâce à la « vision d'aigle ». Lucy entre et lui demande de rentrer à nouveau dans l'Animus. Il assiste alors à la naissance d'un certain Ezio Auditore da Firenze. Les deux fuient ensuite rapidement le bâtiment d'Abstergo. Arrivé à un entrepôt qui semble être la cachette des Assassins, Lucy explique qu'elle voudrait avoir Desmond dans leur camp. Elle lui propose de s'entraîner rapidement grâce à l'effet secondaire de l'Animus qui lui permettra d'acquérir l'expérience d'Ezio, son ancêtre. Desmond accepte et rencontre le reste de l'équipe : Rebecca Crane qui s'occupe de l'Animus 2.0 des Assassins, et Shaun Hastings, tacticien et historien sarcastique. Desmond ne tarde pas à rentrer dans la machine…